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基因表达调控 非编码RNA circRNA测序

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       circRNA是一大类非线性RNA,作为调控因子发挥着巨大作用。circRNA具有大量存在,进化保守,在细胞质中相对稳定的特点。这使得circRNA具有许多的功能,例如作为miRNA的海绵,绑定RNA形成RNA-蛋白复合物,调控基因的转录。circRNA测序能够在整体水平上解释样品中circRNA的分类信息、表达量信息等,通过分析其与miRNA的互作关系探讨ceRNA调控机制。 

适用范围

  基础研究:

   1人类正常组织、细胞、发育阶段的circRNA表达谱

   2疾病或者肿瘤组织中环状RNA表达谱

   3circRNA的功能和调控机制研究

  临床运用:

   1新型的分子标志物 

技术优势     

  1)文库优化:采用核糖体去除、链特异性文库构建、以及RNase R消化方案,全面捕捉circRNA片段

  2)物种多元:可以检测几乎任何动植物的环状RNA

  3)结果精准:多款circRNA预测鉴定软件

  4)ceRNA机制:多种ncRNA联合分析,全面解读生命现象

  5)经验丰富,实验流程成熟,数据可靠


实验流程


生信分析




技术参数



样本要求

动物:≥1 g

植物:≥2 g

真菌:菌丝或者菌体称重(每管200 mg),≥3

全血:≥ 2 mL

细胞: 5×106 cells

RNA要求

μg200 ng/μL

建库测序

去核糖体,去线性,链特异性文库,Illumina PE150测序

数据量

10G clean data


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案例一:环状RNA标记预测胰腺导管腺癌对吉西他滨的耐药性研究


吉西他滨是一种晚期胰腺癌重要治疗药物,在疾病治疗过程中起重要作用。本篇文章作者首先获得吉西他滨的耐药细胞株,通过手段对比耐药细胞株和正常细胞株中环状RNA的表达谱。作者选取差异表达前10的环状RNA进行环状RNA定量PCR验证测序结果,准确性高达100%,说明测序结果真实可靠。

 

研究思路:

 

 

分析结果:

 

1 PANC-1-GR细胞与亲代PANC-1细胞的circRNA表达谱,差异基因表达分析显示,126circRNA在这两种细胞系中的表达存在显著差异,与PANC-1细胞相比,PANC-1-GR细胞中有68种上调,58种下调。

 

利用TargetScan进行序列分析,分析两个circRNAs的潜在结合miRNAs,结果预测chr14101402109-101464448Cchr452729603-52780244C能够结合一系列已知功能的miRNA,提示它们在PDAC对吉西他滨耐药中的潜在作用。

 

案例二:脱水胁迫下小麦叶片环状RNA及其靶标的鉴定


河南农业大学的研究团队利用,首次在小麦幼苗叶片中鉴定出大约88个环状RNA分子,而在脱水胁迫幼苗中有62个环状RNA分子存在差异表达。在脱水反应的环状RNA分子中,有6个在小麦中作为26个相应的miRNA的海绵。利用qPCR验证16个环状RNA,包括6miRNA海绵和10个随机选择的环状RNA,其中14个环状RNA与测序结果趋势一致,反应测序数据的真实性可靠性。GO分析和KEGG分析揭示circRNAs潜在的生物学功能,例如所涉及的参与脱水反应过程,如光合作用,叶绿素代谢,氧化磷酸化,氨基酸生物合成、代谢以及植物激素信号转导和生长素生物合成等。并且揭示了环状RNA与小麦叶片脱水抗性相关功能基因表达之间关系。

 

研究思路:

 

分析结果:

 

根据序列读数,通过CIRI软件在两个小麦叶片处理中共鉴定出88个候选的circRNAs。其中6个(6。8%)是由单个蛋白质编码基因外显子产生的外显子CircRNA53个(60.2%)是由基因间区(基因间区CircRNAs)产生的,2个(2。3%circRNA由内含子产生,另两个(2。3%)由单个蛋白质编码基因的反义链产生,分别称为内含子和反义circRNAs。其余25个(28.4%)的circRNA是由正义重叠区域产生的。

 

为了解与差异表达的circRNAs相关的基因功能,使用BLAST2GO软件进行GO分析。GO功能分类从539个预测的mRNA中生成了843个注释,其涉及参与脱水反应过程,如光合作用,叶绿素代谢,氧化磷酸化,氨基酸生物合成、代谢以及植物激素信号转导和生长素生物合成等。

 

参考文献:

[1] Shao F, Huang M, Meng F T, et al. Circular RNA Signature Predicts Gemcitabine Resistance of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma[J]. Frontiers in Pharmacology, 2018, 9: 584.

[2] Wang Y X, Yang M, Wei S M, et al。 Identification of Circular RNAs and Their Targets in Leaves of Triticum aestivum L。 under Dehydration Stress[J]。 Frontiers in Plant Science, 2017, 7(2024)。

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